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Défis de l'imagerie des modèles in vitro ; Partie 1 : Champ de vision

Défis de l'imagerie des modèles in vitro ; Partie 1 : Champ de vision Par Parisa Iloun, avril 2026 Dans le domaine des neurosciences, les échantillons biologiques englobent une vaste gamme de structures. Il s'agit notamment de sphéroïdes, d'organoïdes et d'assembloïdes, ainsi que de modèles in vivo tels que le poisson-zèbre, C. elegans, des embryons de drosophile et des préparations in vitro comme des tranches de cerveau entier de rongeurs, entre autres. Dans un contexte expérimental, l'imagerie de ces échantillons dans leur intégralité à résolution cellulaire peut aider à répondre à des questions clés, par exemple pour étudier des processus fonctionnels tels que le dysfonctionnement des réseaux neuronaux dans des modèles de maladies ou l'activité synchronisée à travers des réseaux interconnectés. L'imagerie de la structure entière est également essentielle pour étudier la dynamique du développement, notamment la migration cellulaire et la croissance des projections axonales sous forme d'organoïdes interconnectés pour établir des circuits neuronaux fonctionnels. Cependant, la saisie de la structure complète de ces modèles reste un défi, principalement en raison de leur taille relativement importante. Les sphéroïdes mesurent généralement entre 100 et 500 µm, les organoïdes entre 0.5 et 3 mm, et les assembloïdes peuvent atteindre 1 à 4 mm ou plus. Des organismes entiers, tels que des larves de poisson-zèbre et des tranches de cerveau, peuvent également mesurer plusieurs millimètres. En revanche, le champ de vision (FOV) de nombreuses techniques de microscopie couramment utilisées est soit limité à quelques centaines de micromètres seulement, soit, à des FOV plus larges, elles ne peuvent pas fournir une résolution monocellulaire. Il existe donc un compromis entre la résolution et le champ de vision, de nombreuses techniques de microscope étant optimisées pour l'une ou l'autre, sans pouvoir fournir un large champ de vision avec une résolution cellulaire. À gauche : image de l'assembloïde, acquise avec VoluScanTM, à droite : neurones individuels identifiés et traces cellulaires extraites avec le logiciel d'analyse danseTM. Par exemple, la microscopie à deux photons est optimisée pour une haute résolution spatiale et l'imagerie des tissus profonds [2]. Elle permet la visualisation des structures subcellulaires et peut pénétrer plus profondément dans les tissus diffusants que la microscopie à fluorescence conventionnelle. Cependant, cela se fait au détriment d'un champ de vision limité, ce qui le rend moins adapté à l'imagerie de la dynamique cellulaire sur une grande structure. Parallèlement, les microscopes à épifluorescence classiques présentent le défi inverse : les échantillons de taille moyenne (< 2.5 mm) nécessitent un objectif à plus faible grossissement pour être imagés dans leur intégralité, ce qui réduit généralement la résolution optique et la collecte du signal. De plus, ces types de microscopes ne peuvent pas imager de grands échantillons (2.5 à 5 mm). En revanche, la microscopie à feuille de lumière offre une approche alternative en permettant une imagerie volumétrique rapide et des champs de vision relativement larges [3]. Il est particulièrement bien adapté à l'imagerie d'organoïdes entiers, d'assembloïdes ou de cerveaux de poissons-zèbres. Cependant, ces systèmes sont souvent complexes, nécessitent une préparation d'échantillons spécialisée et peuvent être excessivement coûteux, ce qui limite leur accessibilité pour de nombreux laboratoires. Il existe donc un besoin en solutions d'imagerie offrant des champs de vision à l'échelle millimétrique tout en préservant la résolution cellulaire, à un coût abordable. Pour combler cette lacune, chez Doric Lenses, nous avons développé un système de microscopie avancé : le microscope à épifluorescence monophotonique VoluScan™. Le système VoluScan™ peut imager de grands échantillons à l'échelle millimétrique (jusqu'à un champ de vision d'environ 5 x 5 mm, soit environ deux fois plus grand que les microscopes à fluorescence classiques) tout en maintenant une résolution cellulaire (résolution d'environ 2.7 µm) et une couverture en profondeur jusqu'à environ 150 µm. Cela le rend particulièrement précieux pour des applications telles que le suivi de la migration cellulaire, la dynamique des populations ou les modèles d'activité à grande échelle sur des échantillons entiers [5]. Comparaison de la taille relative des échantillons et du champ de vision de VoluScan™ (encadrés bleus). Par ailleurs, pour un échantillon plus petit, inférieur à 2.5 mm, VoluScan™ peut être associé à un objectif à grossissement plus élevé (deux fois supérieur à celui d'un microscope standard), doublant ainsi la résolution optique et augmentant (environ 4 fois) la collecte de fluorescence. Une comparaison entre VoluScan et un microscope épifluorescent conventionnel en termes de champ de vision (FOV) et de résolution utilisant différents objectifs est présentée ci-dessous : Un exemple convaincant de VoluScan™ appliqué à l’imagerie d’assembloïdes à grande échelle provient du laboratoire de Sergiu P. Pașca à l'Université de Stanford. Dans une étude récente, Miura et al. (2024, bioRxiv) a imagé un grand assembloïde (~2 × 2 mm²) composé de quatre organoïdes interconnectés dans son intégralité. En utilisant VoluScan™, les auteurs ont enregistré l'activité calcique des cellules vivantes (GCaMP8s) de plus de 400 cellules au sein d'un seul assemblage et ont démontré un modèle fonctionnel du circuit cortico-striato-thalamique-cortical. La résolution cellulaire obtenue a permis la validation de l’activité neuronale coordonnée dans les quatre régions organoïdes [5]. Image modifiée adaptée de Miura et al. (2024, bioRxiv) De plus, pour répondre aux besoins des applications d'imagerie biologique, VoluScan™ est conçu pour imager une large gamme de capteurs fluorescents, notamment GCaMP, jRGECO, dLight et autres. Le système peut également être facilement intégré à des modalités expérimentales supplémentaires telles que des sources lumineuses (pour l'optogénétique ou le démasquage), des enregistrements électrophysiologiques et des systèmes d'administration de liquides. De plus, VoluScan™ est compatible avec les systèmes de contrôle environnemental tels que la chambre d'incubation Tokai Hit, permettant des conditions d'imagerie cellulaire en temps réel stables à long terme. Le VoluScan™ de deuxième génération (Gen2) est équipé d'une platine 3D motorisée, permettant l'imagerie séquentielle de plusieurs régions sur de grands formats d'échantillons, y compris les plaques à puits et les boîtes de Petri. En définissant à l'avance les régions d'intérêt, les utilisateurs peuvent réaliser des expériences d'imagerie automatisées à haut débit, telles que des acquisitions nocturnes, ce qui accélère considérablement la collecte de données. Références : Clevers, H. (2016). Modélisation du développement et des maladies à l'aide d'organoïdes. Téléphone Lancaster, M. A., et Knoblich, J. A. (2014). Organogenèse en boîte : modélisation du développement et de la maladie à l'aide de technologies organoïdes. Science. Denk, W. et al. (1990). Microscopie de fluorescence à balayage laser biphotonique. Science. Ahrens, M. B. et al. (2013). Imagerie fonctionnelle du cerveau entier à résolution cellulaire par microscopie à feuille de lumière. Méthodes de la nature. Miura, Y. et al. (2024). Modèle Assembloid pour étudier les circuits en boucle du système nerveux humain. BioRxiv